复方一枝蒿颗粒，新疆维吾尔医的特色产品之一。按照维吾尔医学理论来说，具有消灭“乃孜来”,泻火解毒、凉血利咽的功效,主要用来治疗“乃孜来”致使的感冒发烧,咽喉肿痛。按照中医理论来说，其具有解表祛风,凉血解毒的功效，主要用于邪毒导致的感冒发烧,咽喉肿痛,治疗病毒性感冒^[1]。

板蓝根具有抗病毒、抗菌、抗炎、解热、增强机体免疫功能等作用。大青叶对甲型流感病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、单纯性疱疹病毒、巨细胞病毒、登革病毒等有抑制感染并有抑制增殖作用^[2]。国内目前大多都是研究复方一枝蒿颗粒的功效与用途，仅在2006年时，李革等^[3]采用了高效液相色谱法，对复方一枝蒿颗粒中的靛玉红含量进行了研究测定。各种药理学的研究数据表明，板蓝根的抗炎作用及免疫调节功能主要是与其中所含有的生物碱成分和核苷类成分有关，这些化学成分主要起着阻碍病毒核酸的合成、抑菌抗炎、调节免疫功能以及抗肿瘤的功效，具有极强的药理活性^[4]。

复方一枝蒿颗粒收载在《国家药品中药标准（内科 肺系（一）分册）》，标准仅有鉴别、检查和浸出物3个项目。其水提物中含有抗病毒活性成分腺苷，可采用高效液相色谱法测定腺苷的含量。该方法准确可靠，可用于复方一枝蒿颗粒的质量控制和标准提高。

1    材料与仪器

1.1 试验材料与试剂

复方一枝蒿颗粒（3个批次批号分别为：200102283、200226165、200337103，厂家：新疆银朵兰维药股份有限公司）、腺苷对照品（批号：110879-201703，含量：99.7%，厂家：中国食品药品检定研究院）、一枝蒿（产地：河北）、甲醇（批号：V20MAY0101VH，厂家：广州市同源化工科技有限公司）、乙醇（批号：2019120103，厂家：广州化学试剂厂）、超纯水

1.2  仪器

电子分析天平（型号：HA125SM，厂家：瑞士 Precisa）、高效液相色谱仪（型号：Waters e2695，厂家：美国Waters）、高速粉碎机（型号：KC-02，厂家：北京开创同和科技发展有限公司）、套式恒温器（型号：HWS-12，厂家：上海一恒科学仪器有限公司）、超声清洗器（型号：SB5200，厂家：上海必能信超声有限公司）、超纯水设备（型号：ULPHW-IV，厂家：优普）

2    实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱：CAPCELL PAK-C18柱（4.6mmI.D.×250mm，5μm)；流动相：甲醇-水（7:93）；检测波长：260nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：10μL。 

2.2 对照品溶液制备

称取腺苷对照品0.01043g，置50mL容量瓶中，用10%甲醇溶解后再稀释定容至刻度，摇匀后即得每1mL溶液中含0.2080mg的腺苷，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液1.00mL到10mL容量瓶中，用10%甲醇稀释定容至刻度，摇匀，即得每1mL含0.02080mg的腺苷溶液，滤过，取续滤液作为对照品溶液。

2.3供试品溶液制备

取复方一枝蒿颗粒适量研细，精密称量，约5g，置具塞锥形瓶中，精密加入25mL10%甲醇，称定，超声处理30min后，取出，冷却至室温后，重新称定，用10%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性对照溶液制备

复方一枝蒿颗粒处方中仅含有一枝蒿、板蓝根、大青叶三种药材，按照处方比例将一定量的一枝蒿及其辅料，参照复方一枝蒿颗粒的制备工艺制成不含有板蓝根和大青叶的阴性溶液，再按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法进行处理，即得阴性对照溶液。

3   方法学验证

3.1 专属性试验

按照“2.1”项下的色谱条件，将复方一枝蒿颗粒的阴性对照溶液、供试品溶液以及对照品溶液三者依次进样分析，记录相应的色谱图。由图1、2、3可知，供试品溶液检出与腺苷对照品保留时间一致的色谱峰，而阴性对照溶液在相应的保留时间处无色谱峰，对测定结果无干扰。

图1 阴性对照溶液色谱图    图2 供试品溶液色谱图   图3 对照品溶液色谱图

3.2 线性关系考察

精密量取腺苷对照品贮备溶液（0.2080mg/mL）分别置容量瓶中，加10%甲醇稀释定容，得到浓度为4.16、10.4、20.8、41.6、62.4、83.2、104μg/mL的腺苷对照品溶液，摇匀，滤过。按照“2.1”项下的色谱条件，依次进样分析，得到相应的色谱峰面积。以腺苷对照品溶液的浓度为横坐标x轴，峰面积为纵坐标y轴，绘制标准曲线图，得到标准曲线方程以及相关系数。腺苷的回归方程为y=32082x-31467，相关系数R²=0.9997（n=7），在0.0416~1.04μg范围内线性关系良好。

3.3 进样精密度试验

按照“2.1”项下的色谱条件，精密吸取腺苷对照品溶液（0.02080mg/mL）10μL，重复进样七次，测定腺苷峰面积并计算峰面积相对标准偏差。RSD为1.0%(n=7)，小于1.5%，仪器进样精密度良好。

3.4 加样回收率试验

精密量取腺苷对照品贮备溶液（0.2080mg/mL）15mL，置50mL容量瓶中，加10%甲醇稀释定容，得到浓度为62.4μg/mL的腺苷对照品溶液，备用。取已知含量的复方一枝蒿颗粒适量（批号：200102283），研细，精密称取六份，每份约2.5g，分别置同一规格的具塞锥形瓶中，依次精密加入5mL腺苷对照品溶液（腺苷浓度为62.4μg/mL），按照“2.3”项下供试品溶液的制备方法进行处理。然后按照“2.1”项下的色谱条件进行进样，测得腺苷峰面积，计算腺苷的加样回收率以及RSD值。由加样回收率试验结果可知，腺苷的平均回收率为94.67%，RSD=1.3%（n=6），具体结果见表1。

表1 加样回收率试验结果(n=6)

3.5 样品含量测定结果

取3批复方一枝蒿颗粒（批号：200226165、200337103、200102283），分别按“2.3”项下供试品溶液的制备方法进行处理，按照“2.1”项下的色谱条件，测定腺苷峰面积，计算腺苷的含量。3批复方一枝蒿颗粒中腺苷的含量分别为159.1103μg/g、119.1917μg/g、135.0473μg/g。

4    讨论

4.1 提取方法的考察

试验结果显示，超声提取与回流提取结果没有明显的差异，回流提取操作繁琐，超声提取效果好且简单快捷，故选择超声提取作为供试品的提取方法。

4.2 提取溶剂、提取时间的考察

以10%甲醇、15%甲醇作为溶剂进行提取并测定，结果含量没有明显的差异。以10%甲醇为溶剂，考察了不同超声时间10、20、30、45、60 min 所提取的腺苷含量，测得超声30min后腺苷含量无明显增加。将提取溶剂为10%甲醇、超声时间为30min作为前提，考察了不同溶剂量10、20、25、50mL所提取的腺苷含量，测得溶剂量为25mL时腺苷提取完全。秉着环保、减少环境污染的理念，确定提取溶剂为10%甲醇，超声时间为30min，提取溶剂量为25mL。

4.3 小结

研究中发现，同一厂家不同批次的复方一枝蒿颗粒剂中腺苷的含量差异较为明显。本研究建立的HPLC法测定复方一枝蒿颗粒中腺苷的含量，方法准确、简单、快捷。该方法可作为现行标准的有效补充，为复方一枝蒿颗粒制剂生产过程的质量控制提供一定的参考。

参考文献

[1]王静,陈秀娟,李彩霞.复方一枝蒿颗粒浸出物含量测定方法研究[J].科技风，2015(16):104.

[2]罗芬.大青叶水提物抗甲型流感病毒活性研究[J].新乡医院学报，2017,34(10):881-884.

[3]李革，侯桂萍，徐鸿，等.复方一枝蒿颗粒质量标准的研究[J].中医药学刊,2003,(11):1963-1964.

[4]杨海霞，李晓眠.板蓝根提取液体内抗流感病毒作用的研究[J].天津医科大学学报，2007, 13 (1) :19.