课题归属单位 :江西省儿童医院

 课题名称: 雷公藤内酯醇调控TGF-β/Notch信号在胶质瘤细胞侵袭迁移中的影响及机制研究

课题编号: 江西省卫生健康委科技计划课题:（编号:202130873）

前  言

中枢神经系统肿瘤是儿童最常见的实体肿瘤之一，约占儿童肿瘤的15％～20％。其中，神经胶质瘤是颅内发病率和病死率最高的原发性中枢神经系统肿瘤之一，约占颅内肿瘤的45％，具有高度恶性和侵袭性。尽管医学和综合治疗方法有了很大的进步，但恶性胶质瘤的最终预后仍然不容乐观，确诊后一年的死亡率超过70％。因此，急需寻找新的靶点和治疗方法来改善神经胶质瘤的治疗效果。本研究旨在探索雷公藤内酯醇对TGF-β和Notch信号通路在胶质母细胞瘤细胞侵袭和迁移中的影响及其作用机制。通过体外细胞试验和分子生物学技术，我们将评估雷公藤内酯醇对胶质母细胞瘤细胞侵袭和迁移能力的影响，并检测其对TGF-β和Notch信号通路的调控作用。此外，我们还将使用信号通路激活剂或抑制剂进行功能验证试验，以揭示雷公藤内酯醇调控TGF-β和Notch信号通路在胶质母细胞瘤细胞侵袭和迁移中的具体机制。通过这些研究，我们希望揭示雷公藤内酯醇对TGF-β和Notch信号通路的调控作用，以及其在胶质母细胞瘤细胞侵袭和迁移中的具体机制。这将为胶质母细胞瘤的治疗提供新的潜在靶点和治疗策略，为开发更有效的抗癌药物提供理论基础，并为临床治疗提供新的思路。
1 材料和方法

1.1  细胞株

人脑胶质瘤细胞系U87细胞株购于***。

1.2 方法

本研究主要通过不同实验方法检测雷公藤内酯醇对人脑胶质瘤细胞U87的影响。使用DMEM培养基培养U87细胞。采用CCK-8法检测不同浓度的雷公藤内酯醇处理U87细胞72小时后的细胞增殖情况。根据预实验结果，选择28 nM浓度的雷公藤内酯醇处理U87细胞作为试验组，以同体积的DMSO处理U87细胞作为对照组。细胞处理72小时后，加入CCK-8溶液，孵育1小时后检测吸光度。接着，使用划痕实验和Transwell小室实验分别检测雷公藤内酯醇对U87细胞的侵袭和迁移能力的影响。另外，通过Real-Time PCR检测雷公藤内酯醇对U87细胞中TGF-β1、MMP-2、MMP-9以及notch信号通路中notch1、Jagged1、Hes和VEGF的mRNA转录水平的影响。最后，使用蛋白印迹法检测雷公藤内酯醇对U87胶质瘤细胞蛋白活性的影响。此外，还将使用质粒转染过表达TGF-β来观察雷公藤内酯醇对U87细胞的侵袭和迁移能力的影响。

2 结果

2.1 雷公藤内酯醇抑制U87细胞系的增殖、迁移及侵袭能力

CCK-8细胞增殖实验检测发现，雷公藤内酯醇处理后的U87细胞增殖活力明显弱于对照组细胞；细胞划痕实验检测U87细胞的48小时迁移距离，结果表示，雷公藤内酯醇处理后的U87细胞的迁移能力显著低于对照组细胞；Transwell细胞侵袭实验结果同样发现，相比于对照组，雷公藤内酯醇处理后的U87细胞的侵袭能力明显减弱。因此本研究认为，雷公藤内酯醇对U87细胞的增殖、迁移以及侵袭能力均有显著的抑制作用。

2.2 Notchl/Hesl基因在U87细胞中表达

 RT-PCR检测U87细胞中Notch1、Hes1基因均有表达，免疫荧光染色和Western Blot检测结果表明在U87细胞经不同处理因素作用48h后，Notch1、Hes1各组均有表达，为FITC绿色荧光标记，表达在U87细胞胞浆，提示Notchl/Hesl信号通路在U87细胞中存在。

2.3 Notch信号对U87细胞活力的影响

MTT检测结果表明，激活了Notch信号途径的rhNF-κB组细胞有较高的活力，DAPT（Notch信号通路抑制剂）组和对照组的细胞活力较差，发生了不同程度的凋亡，差异有显著性意义(P<0.05)。说明U87细胞中Notch信号通路有明显的保持细胞活力，抑制凋亡的作用。

2.4 Notch信号对U87细胞凋亡的影响

通过流式细胞仪、免疫荧光染色和Western Blot检测的结果发现，与对照组相比，DAPT组细胞凋亡明显，而rhNF-κB组细胞凋亡较少，差异有显著性意义（P<0.05），说明Notch信号系统有调控U87细胞凋亡的作用，rhNF-κB诱导后激活Notch信号抗U87细胞凋亡，DAPT诱导后抑制Notch信号促进凋亡。

2.5 雷公藤内酯醇抑制TGF-β1信号通路

本研究用28 nM浓度雷公藤内酯醇处理U87细胞24h，通过Western blot实验检测TGF-β1蛋白的表达量。结果表明，TGF-β1蛋白质表达量也显著降低。因此，本研究推断TGF-β1通路可能是雷公藤内酯醇抑制U87细胞迁移和侵袭的过程中的重要靶通路。

2.6 过表达TGF-β1可拮抗雷公藤内酯对U87细胞增殖、迁移及侵袭能力的抑制作用

通过CCK-8细胞增殖实验、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验验证相同浓度下雷公藤内酯醇对过表达U87细胞的增殖、迁移和侵袭能力的抑制。结果表明，28 nM浓度的雷公藤内酯醇分别处理过表达TGF-β1的U87细胞和对照组U87细胞后，TGF-β1过表达组的U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力，比阴性对照组的U87细胞受雷公藤内酯醇抑制程度更弱。因此，与本研究推测的结果一致，TGF-β1通路是雷公藤内酯醇抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭能力的重要靶通路。

3 讨论

胶质母细胞瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤。恶性胶质瘤具有高度侵袭性和复发性，治疗效果较差，预后不良。研究表明，雷公藤内酯通过诱导细胞死亡和G2/M细胞周期停滞对胶质瘤细胞具有细胞毒性，同时抑制恶性胶质瘤细胞的增殖。本研究通过CCK-8细胞增殖实验发现，雷公藤内酯醇处理后的U87细胞增殖活力明显低于对照组。这表明雷公藤内酯醇具有抑制U87细胞增殖的能力。此结果与之前相关研究结果一致。此外，细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验的结果显示，雷公藤内酯醇处理后的U87细胞迁移和侵袭能力均显著减弱。这表明雷公藤内酯醇不仅能够抑制U87细胞的增殖，还能够抑制其迁移和侵袭能力。这些结果进一步证实了雷公藤内酯醇对U87细胞的抑制作用。

Notch信号通路是多细胞生物体内具有高度保守性的细胞间信号传导途径，参与对细胞增殖、分化、凋亡的调控，Notch信号通路主要包括受体、配体和CSL或CBF1蛋白（DNA结合蛋白）3部分^[1]。目前哺乳动物中已发现4种同源受体，分别是Notch1、Notch2、Notch3和Notch4；5种配体，分别是Delta1、Delta3、Delta4和Jagged1、Jagged2，两类靶基因：Hes和Hey家族。Notch受体是一种跨膜蛋白，受体与相邻细胞膜上的配体结合后受体构象发生改变，曝露出酶切位点，在蛋白水解作用下释放出具有生物活性的胞内片段（Notch intracellular domain，NICD）并转移至细胞核内与CSL或CBF1蛋白结合后激活下游的靶基因，从而发挥生物调节作用。我们前期的研究也证试，通过激活剂rhNF-κB诱导后激活Notch信号，可促进胶质瘤U87细胞增殖，逃避凋亡，阻断剂DAPT诱导后抑制Notch信号，促进U87细胞凋亡，抑制增殖。Notch信号通路在中枢神经系统发育中发挥了关键作用，对胶质瘤细胞的生长、增殖、凋亡等过程起到决定作用^[2]。进一步的研究发现，在U87细胞中Notch1和Hes1基因均有表达，并且Notch1和Hes1蛋白在U87细胞中可见。此外，激活Notch信号通路的rhNF-κB组细胞具有较高的活力，而Notch信号通路抑制剂DAPT组和对照组细胞的活力较差且发生了不同程度的凋亡。这表明Notch信号通路在U87细胞中发挥了保持细胞活力、抑制凋亡的作用。进一步的实验结果显示，DAPT组细胞凋亡明显，而rhNF-κB组细胞凋亡较少。这表明Notch信号系统在调控U87细胞凋亡中起着重要的作用。rhNF-κB诱导后激活Notch信号可抗U87细胞凋亡，而DAPT诱导后抑制Notch信号则促进凋亡。这些结果表明Notch信号通路在U87细胞的生长和存活中起到重要的调控作用。

转化生长因子(Transforming growth factor-β, TGF-β)是一组负责调控细胞的生长、分化和增殖的多效性细胞因子，其中转化生长因子β1（TGF-β1）是TGF-β超家族中的一种多功能的生长调控因子，之前的研究主要集中在其参与炎症、组织修复方面，近几年来研究发现，TGF-β1与细胞的分化、生长与发育等密切相关。TGF-β1参与了许多肿瘤细胞的调控作用，研究已证试TGF-β对人恶性胶质瘤U87细胞的侵袭、迁移的具有诱导作用，从而促进胶质瘤的进展，将TGF-β1信号通路作为靶点已成为胶质瘤治疗策略之一^[3]。在本研究中发现，雷公藤内酯醇处理后U87细胞中TGF-β1蛋白的表达量显著降低。进一步的实验结果表明，过表达TGF-β1的U87细胞对雷公藤内酯醇的抑制作用较弱，其增殖、迁移和侵袭能力相比阴性对照组的U87细胞受到的抑制程度更小。这表明TGF-β1通路可能是雷公藤内酯醇抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的重要靶通路。

综上所述，本研究的结果表明雷公藤内酯醇能够抑制U87细胞的增殖、迁移和侵袭能力。此外，Notch和TGF-β1信号通路在其中发挥了重要的作用。Notch信号通路在U87细胞中起到保持细胞活力、抑制凋亡的作用，而TGF-β1可能是雷公藤内酯醇抑制U87细胞增殖、迁移和侵袭的重要靶点。

参考文献

[1] 刘锋, 吕世刚, 祝新根等. Notch1信号通路在人脑胶质瘤U87细胞增殖、凋亡中的作用及机制探讨[J]. 山东医药, 2012, 52(02) : 4-6.

[2] Zhang Y, Zhang J, Navrazhina K, et al. TGFbeta1 induces Jagged1 expression in astrocytes via ALK5 and Smad3 and regulates the balance between oligodendrocyte progenitor proliferation and differentiation. Glia. 2010 Jun;58(8):964-74. doi: 10.1002/glia.20978. PMID: 20169621; PMCID: PMC2913704.

[3] Farooqi AA, Khalid S, Ahmad A. Regulation of Cell Signaling Pathways and miRNAs by Resveratrol in Different Cancers. Int J Mol Sci. 2018 Feb 26;19(3):652. doi: 10.3390/ijms19030652. PMID: 29495357; PMCID: PMC5877513.