禁抗时代来临后，未来发展趋势为全面减抗，中兽药为当前替代抗生素较为合适的药品，所以，为研发中兽药新药带来更多机遇。但是研发全新的中兽药产出小，且投入大，且还需考察其安全性，为使开发新兽药的周期缩短，风险降低并使开发新兽药成功几率提高，临床开始关注人药转兽药，传统秘方验方、经典名方的再开发乃研发新兽药的一种关键途径^[1]。清热灵颗粒的作用在于清热解毒，可用于感冒热邪壅肺证的治疗，其针对鸡感冒发热可会一定治疗效果。该药组方含甘草、大青叶、连翘、黄芩等中药，其含量控制指标为黄芩苷，在黄芩药材中，含黄芩苷的量超8%，量较高，水提传统工艺极易达到含量的控制指标。但作为方剂关键成分，连翘自身仅含较少的连翘苷，低于3%，所以，在确保含黄芩苷量的基础上，如何尽量高的提出制剂内其他成分，使多成分含量提高，保证制剂疗效，乃中兽药关键研发工作。本文主要经对比超声、醇提、合煎、分煎等提取手段，明确提取复方制剂内连翘最佳的工艺。

1材料

1.1 试药

于大药房购买甘草、大青叶、连翘、黄芩等，连翘苷对照品源自中国食品药品检定研究院； 95%乙醇，分析纯，源自天津市北辰方正试剂厂；乙腈，色谱纯，美国天地化学试剂公司；甲醇，色谱纯，源自天津市四友精细化学品有限公司；中性氧化铝，分析纯，源自福晨（天津）化学试剂有限公司。

1.2 仪器

取高效液相色谱仪，取GOLD C18色谱柱Hypersil， 0.00001 g BT125D电子天平，数字酸度仪pH-3C，提取中药设备，超声清洗仪，旋转蒸发仪，源自上海亚荣生化仪器厂。

2 方法

2.1合煎法

各取250g大青叶、连翘、黄芩，50g甘草，浸泡0.5h后，加入12倍水，开始煎煮，实施2次，15h/次，行2次煎液，待过滤后，浓缩滤液至800ml，让含生药量达1 g/ml。

2.2 分煎法

取250g连翘药材，实施0.5h浸泡，加入12倍水，开始煎煮，开展2次，15h/次；另取250g黄芩、250g大青叶、50g甘草，浸泡0.5h后，取12倍水开始煎煮，15h/次，开展2次，伴连翘与另外3中药材的煎液，将其浓缩为800ml，让含生药量达1 g/ml。

2.3 超声提取法

各取250g大青叶、连翘、黄芩，50g甘草，药材粉碎，以料液比1:10将75%乙醇加入，开始0.5h浸泡，实施2次超声提取，0.5h/次，将两次收集的液体合并，过滤，借助仪器浓缩滤液至800ml，让含生药量大1 g/ml^[2]。

2.4乙醇回流提取

大青叶、连翘、黄芩各取250g，加50g甘草，以料液比1:10将85%乙醇加入，0.5h浸泡后，实施2次回流提取，1.5h/次,将两次收集液体合并，过滤后，借助仪器浓缩，最终达800ml，让含生药量达1g/ml^[3]。

2.5制备 样品溶液

2.5.1制备对照品溶液

取适量连翘苷对照品，精密称定，取甲醇50%制成1ml含100μg溶液。

2.5.2制备供试品溶液

以精密仪器量取1ml提取液，放置在中性氧化铝柱上，内径1 cm、6 g、100~120目，以40ml 70%乙醇洗脱，洗脱液收集，浓缩至干，取适量甲醇溶解残渣，取5ml量瓶转移，加甲醇达刻度，而后摇匀，即可^[4]。

2.5.3色谱条件

取Hypersil GOLD C18色谱柱，尺寸为4.6mm×250 mm，5 um；流动相为乙腈-0.2%磷酸溶液，25∶75，等度洗脱，设置1 ml/min流速，进样量10 ul，检测波长为277 nm。

2.6考察方法学

2.6.1考察线性关系

取适量连翘苷对照品，制作0.4 mg/ml溶液，并依次倍比稀释对照品溶液为一定质量浓度的溶液，即0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mg/ml，分别检测HPLC，色谱图记录，横坐标为对照品溶液质量浓度，纵坐标为平均峰面积，标准曲线绘制，计算线性范围、相关系数、回归方程^[5]。

2.6.2重复性试验

提取液取适量，制备成平均6份供试品溶液，检测HPLC，确定峰面积并记录，RSD（相对标准偏差）计算^[6]。

2.6.3定性试验

制备提取液成为供试品溶液，完成配置后，开展检测，检测时间分别为第0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，峰面积记录，RSD计算。

2.6.4密度试验

连翘苷对照品溶液实施重复连续6次进样，确定峰面积，RSD计算。

2.6.5 加样回收率

取同一批含量已测知的9份提取液，制备成为供试品溶液，以加入对照品量、提取液内含连翘苷的量比1∶0.5、1∶1、1∶1.5，将连翘苷分别加入对照品内，每个浓度重复3个，确定峰面积，记录并计算RSD、回收率^[7]。

2.6.6测定提取液含量

将提取不同工艺所获提取液取出，供试品溶液制备，以色谱方法检测HPLC，峰面积确定并记录，计算提取液内含连翘苷的量^[8]。

3结果

3.1考察线性关系结果

考察连翘苷线性关系结果获得线性回归方程，即y=1E+07x+3 084.7，R 2 =1，提示0.012 5~0.4 mg/ml范围内，说明线性关系好。

3.2精密度试验

取对照品溶液，连翘苷重复连续进样6次，获得精密度试验的结果，见表1，对照品溶液RSD0.2%，提示仪器存在良好的精密度。

表1  精密度试验

3.3重复性试验

     提取液制备成6份供试品溶液，取得重复性试验数值，见表2，检测对照品连翘苷溶液RSD0.9%，提示该试验具良好重复性。

表2  重复性试验

3.4稳定性试验

制备提取液成供试品溶液，配置结束后分别取不同时间段（0h、2h、4h、8h、12h、24h）实施进样检测，取得结果可见表3，放置样品溶液24h后，含连翘苷量为0.42 mg/ml，相较与0h，下降程度不显著，RSD1.28%，提示样品溶液24h内较为稳定。

表3   稳定性试验

3.5加样回收率试验

加样回收率试验可见，加样不同浓度，样品加样平均回收率99.5%，RSD 0.8%，提示该检测手段具良好准确度。

表4  加样回收率试验

3.6检测提取液含量

通过以上手段逐步考察验证后，提取不同方式所获清热灵颗粒提取液内含连翘苷的量结果见表5，合煎所获数值含连翘苷量最高，即0.41 mg/ml，次之为分煎，即0.37 mg/ml，超声提取、乙醇回流提取所获数值含连翘苷的量较低，即0.28 mg/ml、0.30 mg/ml，提示借助整体投料，水提传统工艺提取连翘苷的几率最高，可达66.6%。

表5检测提取液含量

4讨论

清热灵颗粒组方含甘草、大青叶、连翘、黄芩，黄芩苦寒，乃君药，可清肺泻热；连翘可清热解毒，疏散风寒，亦可辟秽化浊，不仅可透散卫分表邪，同时温热病邪易蕴结成毒特点可兼顾，其为臣药，大青叶可凉血散斑，清热解毒，甘草的作用在于调和诸药，乃使药^[9]。有关文献指出^[10-13]，黄芩苷除外，连翘苷亦可抗病毒抗菌，乃清热灵颗粒药效学的物质基础。本文借助提取不同工艺对比分析提取连翘苷最佳的工艺，即超声提、醇提、合煎、分煎等。

煎煮法乃提取最为传统的一种方法，为煎剂质量提高、确保安全给药的一个关键环节，中医精髓得以体现^[14]。乙醇回流提取手段是借助乙醇有机溶剂易挥发完成原料成分提取，加热蒸馏浸出液，馏出挥发性溶剂后，再次冷却，再次置于浸出容器中开始原料提取，如此这般重复，直至完全提取有效成分。超声提取是借助超声波强烈的搅拌、空化等效应，将植物细胞壁破坏，传质阻力减少，迅速溶出有效成分^[15]。

本文结果可见，于众多提取工艺中，水提传统手艺提取清热灵颗粒中含连翘苷的量最高，特别是复方药材整体投料，超声提取、回流提取的几率相对较低，可能是因连翘苷遇水则溶，与乙醇不溶，所以选择醇提工艺，提取连翘苷的几率较低。综合对比，水煎传统工艺，简单的操作，于实际生产更为适用^[16]。中药复方制剂，具复杂的成分，每味药材据均可展现其药效学效果，所以，应选择提取合适的方法，尽量充分提取每味药材有效成分。

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