基金项目：金华市科技计划项目

课题编号：（2020-4-152)）

课题名称：miRNA-223调节TLR4/NF-κB信号通路在心肌缺血再灌注损伤中的作用机制  

心肌缺血再灌注（I/R）损伤是急性心肌梗死、心脏手术及经皮冠状动脉介入治疗（PCI）后常见的临床并发症，其病理过程以短暂缺血后恢复血流引发的心肌细胞二次损伤为特征，显著影响患者预后[1]。尽管再灌注治疗可挽救缺血心肌，但再灌注本身通过氧化应激、钙超载、线粒体功能障碍及炎性反应等机制加剧细胞损伤，甚至诱发恶性心律失常或心力衰竭[2]。目前临床干预手段（如抗氧化剂、钙通道阻滞剂）虽能部分缓解损伤，但仍存在疗效有限、靶向性不足等问题[3]，因此，深入解析I/R损伤的分子机制并寻找新型治疗靶点具有重要临床意义。

微小RNA（miRNA）作为基因表达的关键调控因子，在心肌I/R损伤中发挥重要作用。研究表明，miRNA可通过调控细胞凋亡、自噬及炎性通路影响损伤进程。例如，miR-21通过激活PI3K/Akt信号通路减少凋亡并促进心肌细胞存活[4]，而miR-140-3p通过抑制PI3K/Akt加剧氧化应激和细胞死亡[5]。这些发现提示，miRNA在不同病理阶段可能呈现双向调控作用，其功能高度依赖于靶基因及信号通路的特异性。

近年研究发现，miR-223-3p在心血管疾病中具有复杂作用。在动脉粥样硬化模型中，miR-223-3p通过抑制NLRP3炎性小体减轻斑块炎症[6]；而在心力衰竭中，其表达下调与心肌纤维化及收缩功能障碍密切相关。值得注意的是，miR-223-3p被证实可直接靶向TLR4 mRNA 3'UTR，抑制TLR4/NF-kB信号通路，从而减轻脓毒症相关心肌炎性损伤。然而，其在心肌I/R损伤中的具体作用尚未明确。TLR4/NF-通路作为炎性反应的核心调控轴，在I/R损伤中通过释放TNF-α、IL-6等促炎因子驱动心肌细胞死亡，但针对该通路的直接抑制剂因全身毒性难以临床应用。若miR-223-3p能够特异性调控TLR4/NF-kB活性，可能为开发精准治疗策略提供新方向。基于此，本研究通过构建H9c2心肌细胞缺氧复氧（H/R）模型，探讨miR-223-3p对细胞活力、炎性因子释放及TLR4/NF-kB通路活性的影响，旨在揭示其在I/R损伤中的调控机制，为靶向miRNA的心肌保护策略提供实验依据。

1 材料与方法 

1. 1 实验材料  

1.11 细胞与试剂  

细胞系：大鼠心肌细胞H9c2（上海赛百慷生物技术有限公司，货号iCell-r012）。

1.12 仪器与软件  

CO₂细胞培养箱（Thermo Scientific，8000）；缺氧工作站（1% O₂、5% CO₂、94% N₂，Heal Force）；酶标仪（BIO-RAD，iMark）；实时荧光定量PCR仪（Roche，LightCycler 480II）； 电泳仪及转膜系统（BIO-RAD，Mini Protein 3 Cell）；化学发光成像仪（天能，Tanon 5200）；  

数据分析软件：GraphPad Prism 8.0、ImageJ、Excel。  

1.2 实验方法  

1.21 细胞培养

从液氮中取出冻存的H9c2细胞，37℃水浴快速解冻，离心（1000 rpm，5 min）后重悬于含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基，接种于60 mm培养皿，置于37℃、5% CO₂培养箱中培养。细胞融合度达80%时，0.25%胰酶消化传代，按1:2比例分瓶，取3~5代细胞用于实验。  

1.22  H/R模型建立  

待细胞贴壁后，更换为无糖DMEM培养基，置于缺氧工作站（1% O₂、5% CO₂、94% N₂，37℃）培养6 h。弃去无糖培养基，更换为含10%胎牛血清的正常DMEM培养基，置于常氧（5% CO₂、95%空气，37℃）培养16 h。  

1.23 统计学分析  

采用SPSS22.0统计软件进行数据分析,定量资料以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 

2.1  miR-223-3p对H9c2细胞活力的影响

CCK8实验结果表明，细胞造模后，细胞活力下调，加入对照后没有变化，加入miR-223-3p inhibitor后，细胞活力进一步下调。

2.2  miR-223-3p表达水平

PCR结果表明，细胞造模后，miR-223-3p表达上调，加入对照后没有变化，加入miR-223-3p inhibitor后，miR-223-3p表达显著下调。  

2.3  Western blot检测  

WB结果表明，构建心肌细胞缺氧复氧模型后，p65和TLR4表达上调，再加入抑制剂处理后，p65和TLR4表达进一步上调。

2.4 炎性因子释放

ELISA结果表明，细胞造模后，TNFα、IL6、LDH表达上调，使用抑制剂干预后，TNFα、IL6、LDH表达进一步上调。 

3 讨论  

本研究首次揭示miR-223-3p在H/R诱导的心肌细胞损伤中通过调控TLR4/NF-kB信号通路发挥关键作用。H/R组中miR-223-3p表达上调（P<0.05），而抑制其表达后，TLR4、p-p65蛋白及炎性因子（TNF-α、IL-6、LDH）水平进一步显著升高（P<0.05），提示miR-223-3p可能通过负向调控TLR4/NF-kB通路减轻炎性损伤。TLR4/NF-kB通路是心肌I/R损伤的核心机制，其激活可诱导TNF-α、IL-6等促炎因子释放。尽管本研究未直接验证靶向关系，但蛋白表达趋势支持二者存在潜在调控。阴性对照组（H/R+NC）与H/R组无显著差异（P>0.05），排除了非特异性干扰，增强了结论可靠性。

综上所述，miR-223-3p可能通过抑制TLR4/NF-kB信号通路减轻H/R诱导的心肌细胞损伤，而抑制其表达可显著加剧炎性反应及细胞死亡。本研究为miRNA调控心肌I/R损伤提供了新视角，但需通过体内实验进一步验证其临床价值。  

参考文献  

Hausenloy DJ, Yellon DM. Myocardial ischemia-reperfusion injury: a neglected therapeutic target[J]. J Clin Invest, 2013, 123(1): 92-100.
[2] Yellon DM, Hausenloy DJ. Myocardial reperfusion injury[J]. N Engl J Med, 2007, 357(11): 1121-1135.
[3] Heusch G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning[J]. Circ Res, 2015, 116(4): 674-699.
[4] Yuan Y, et al. Role mechanism of miR-21 on hypoxia-induced rat cardiomyocyte activity by activating PI3K/Akt signaling pathway[J]. Chongqing Med, 2021, 50(13): 2165-2170.
[5] Zheng W, et al. MiR-140-3p alleviates hypoxia/reoxygenation-induced myocardial cell injury by regulating PI3K/Akt pathway[J]. J Baotou Med, 2024, 40(8): 26-30.
[6] Haneklaus M, et al. miR-223: infection, inflammation and cancer[J]. J Intern Med, 2013, 274(3): 215-226.