基金项目：汕尾市科学技术项目

课题名称：治疗妇科疾病、前列腺疾病的中成药及保健食品中非法添加甲硝唑的快速安全检测方法

项目编号：2014C001

随着人们健康意识的不断提高，治疗妇科疾病、前列腺疾病的中成药及保健食品市场需求不断扩大。然而，部分不法厂商为了追求经济效益，在中成药及保健食品中非法添加甲硝唑等违禁成分，严重危害消费者的身体健康。甲硝唑是一种抗生素，主要用于治疗妇科疾病、前列腺疾病等^[1]。由于其抗菌效果显著，部分厂商将其非法添加到中成药及保健食品中，以提高产品的疗效。然而，长期服用含有甲硝唑的产品可能导致肠道菌群失调、过敏反应等副作用，严重时甚至可能危及生命^[2]。因此，对甲硝唑进行快速、准确的检测具有重要的现实意义。目前，针对中成药及保健食品中非法添加甲硝唑的检测方法主要包括光谱法和生物传感器法等，这些方法虽然在一定范围内取得了较好的效果，但存在操作复杂、灵敏度低、特异性差等问题，难以满足快速、安全检测的需求^[3]。因此，开发一种简单、快速、安全的检测方法对于保障患者健康和安全具有重要意义。本研究选取治疗妇科疾病、前列腺疾病的中成药及保健食品109种，测定了各药品非法添加甲硝唑情况，结果总结如下：

1资料与方法

1.1试剂与仪器  收集市售109种常用治疗妇科疾病、前列腺疾病的中成药及保健食品（如生精片、炎可宁片、康妇软膏、金刚藤胶囊、前列舒乐软胶囊、K哥、黄柏胶囊等）作为试验对象，常见20种药物厂家及批号见表1。研究所用甲硝唑对照品购自中国食品药品检定研究院，使用的仪器为岛津LC-20ADXR高效液相色谱仪、赛多利斯CPA225D十万分之一电子天平和IKA数显型涡旋混合仪Hula dancer DS000。

表1 治疗妇科疾病、前列腺疾病常见20种中成药及保健品

1.2理化鉴别方法  样品溶液制备：取样品粉末（片剂为一片、丸剂为口服量的一半、胶囊剂为一粒）或液体（2ml）置25ml离心管中，加95%乙醇20ml，盖子拧紧涡旋30秒，静置取上清液。理化反应：如果上清液无色澄清，则直接过滤在已加一耳勺氢氧化钠粒的小瓶中；如果上清液带有颜色，则需要取上清液5ml进行过柱处理，将注射器中最后约1~1.5ml溶液过滤在已加一耳勺氢氧化钠粒的小瓶中。将上述已加样品溶液的小瓶放置于热水中约30秒，如为阳性则会呈粉红色。过柱步骤：5ml准备好的过柱注射器（5ml普通塑料注射器，注射器前端用脱脂棉塞住并连接有机性过滤头，注射器内已加入约1g的200~300目中性氧化铝和活性炭10:1的混合物），用塑料滴管沿壁将上清液加入注射器内，样品溶液加入后塞上注射器塞，往下用手加压使注射器内的样品溶液以每秒1~2滴的速度过滤出来，弃去前面过柱出来的溶液，取注射器中最后约1~1.5ml的过滤溶液。

1.3HPLC方法

1.3.1色谱条件  采用C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。采用甲醇、水为流动相，按下表2梯度洗脱程序，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，检测波长为320nm。

表2 甲醇-水梯度洗脱程序表

1.3.2溶液制备  （1）甲硝唑标准品溶液制备：精密称取甲硝唑标准品适量，用流动相溶解，制成浓度为1.0 mg/mL的甲硝唑标准品溶液。（2）中成药及保健食品样品溶液制备：按1.2理化鉴别方法，取注射器中过滤处理最后约1~1.5ml的澄清溶液100ul，置20ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，作为HPLC检测的供试品溶液。

1.3.3 HPLC 法定量测定

①标准曲线及线性范围。将甲硝唑标准品溶液分别进样1、2、5、10、20μl，记录色谱图，以甲硝唑的峰面积为纵坐标，以甲硝唑的进样量为横坐标，绘制标准曲线。

②精密度实验。取中成药、保健食品样品，按照样品测定方法进行前处理，得到待测样品溶液。取待测样品溶液，连续进样6次，每次10µL，记录峰面积，计算相对标准偏差（RSD），以评估方法的精密度。

③重复性试验。取待测样品溶液，在同一天内进行6次重复测定，每次10µL，记录峰面积，计算RSD，以评估方法的重复性。

④稳定性试验。取同一份甲硝唑标准品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，每次10µL，记录色谱图。

⑤加样回收试验。精密称取已知含量的样品适量，分别加入一定量的甲硝唑对照品，按照样品测定的方法进行测定，计算回收率。

⑥样品测定。精密吸取理化鉴别项下经过柱处理的最后过滤出来的澄清溶液100ul，置20ml容量瓶中，用色谱甲醇稀释至刻度，作为HPLC检测的供试品溶液。采用甲醇-水梯度洗脱，洗脱程序见表2。此HPLC改进方法，可同时检测甲硝唑、氟康唑、替硝唑、奥硝唑四种化学物质。

1.3观察指标  采用外标法计算样品中甲硝唑的含量，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品峰面积，从标准曲线上查出对应的浓度，计算样品中甲硝唑的含量。

2结果

2.1样品检测结果分析  109种样品经过理化鉴别及HPLC分析，结果显示107种为阴性，双唑泰栓检测为阳性，作为复方制剂，成份中显示含甲硝唑200mg；1种为假阳性，含有盐酸小檗碱。

2.2线性结果分析  实验结果表明，甲硝唑浓度在0.05-1.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，线性方程为Y=3722.24x-648.25（r=0.9998）。这一结果表明，本实验所建立的HPLC方法具有较高的灵敏度和准确性。

2.3精密度、重复性检测结果分析  对添加了甲硝唑的中成药样品进行精密度测试，测得3次平行样的RSD为2.8%，符合要求（RSD<3%）。这说明该方法具有较好的精密度。对添加了甲硝唑的同一批次的双唑泰栓进行重复性测试，测得5次平行样的RSD为1.7%，符合要求（RSD<3%）。这说明该方法具有较好的重复性。

2.4稳定性试验结果分析  稳定性试验结果表明，该方法在24小时内具有良好的稳定性（表3）。

表3 稳定性试验结果分析

2.5加样回收试验结果分析  低、中、高浓度的加样回收试验溶液的加样回收率分别为97.8%、95.6%、93.4%，RSD分别为2.1%、3.2%、4.5%。结果表明，该方法的加样回收率较高，精密度良好，可以满足检测要求。

3讨论

近年来，随着中成药及保健食品市场需求的不断增长，部分不法商家在生产过程中非法添加西药成分，以增强疗效。其中，甲硝唑作为一种抗菌药物，被广泛用于治疗妇科疾病、前列腺疾病等^[4]。然而，非法添加甲硝唑可能导致患者产生药物依赖、过敏反应等副作用，严重危害消费者健康。因此，对中成药及保健食品中非法添加甲硝唑的检测具有重要意义。为了确保中成药和保健食品的质量和安全性，发展高效液相色谱法(HPLC)技术成为一种重要且有效的手段^[5]。

HPLC是一种基于色谱原理的检测方法，具有高效、快速、灵敏度高等优点。其原理是利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，实现对复杂样品中各组分的分离和检测。HPLC技术能够对药品中的成分进行定量和定性分析，从而识别和检测非法添加的甲硝唑成分。该技术的优势在于高分辨率、高选择性和高灵敏度，可用于精确地分离和检测中成药和保健食品中的甲硝唑^[6]。在HPLC分析中，可以使用适当的流动相、色谱柱和检测器来确保对甲硝唑的准确检测。根据甲硝唑的物化性质，可以选择合适的流动相混合物，如甲醇和水，以实现高效的分离效果。同时，使用合适的色谱柱，如反相色谱柱，可以更好地分离甲硝唑和其他可能存在的干扰物^[7]。在检测器方面，可以选择二极管阵列检测器，以便在适当波长下对甲硝唑进行测定。使用HPLC-DAD方法，可以利用甲硝唑的最大吸收波长及光谱图进行定性和定量分析。此外，为了增加分析的灵敏度和准确性，可以采用前处理方法，如固相萃取(SPE)或液相萃取(LLE)等进行样品净化和浓缩^[8]。本研究109种样品经过理化鉴别及HPLC分析，结果显示107种为阴性，双唑泰栓检测为阳性，作为复方制剂，成份中显示含甲硝唑200mg。甲硝唑浓度在0.05-1.0μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，且经过测试，精密度、重复性及稳定性均较好，体现了HPLC检测非法添加甲硝唑的应用优势。

总之，针对治疗治疗妇科疾病、前列腺疾病的中成药和保健食品中非法添加甲硝唑的问题，HPLC是一种可靠且有效的分析手段，通过该方法，可以准确地鉴别和检测中成药和保健食品中的甲硝唑，保障患者的健康和安全。然而，为了规范中成药和保健食品市场，更重要的是加强药品监管和执法力度，打击非法添加甲硝唑等行为，维护公众的健康权益和社会稳定。

参考文献

[1] 刘云,杨玉忠. 超高效液相色谱-串联质谱法定性定量检测中成药及保健食品中非法添加的17种化学药物[J]. 2020,24(1):82-86.

[2] 胡佳哲,何嘉雯,黄淑霞,等. 超高效液相色谱-串联质谱法测定凉茶中6种非法添加化合物[J]. 2020,39(12):1461-1466.

[3] 刘云,杨玉忠. UPLC-MS/MS快速测定中成药及保健食品中非法添加的6种抗菌药物[J]. 2019,22(7):1364-1366.

[4] 易路遥,蒋诗扬,仲雪,等. 纳米金表面增强拉曼光谱法快速定性定量检测3种非法添加抗感染药物[J]. 2023,59(8):917-922.

[5] 肖瑞娜,李玉丽. 液相色谱-串联质谱法同时测定化妆品中40种抗菌药物[J]. 2020,50(6):419-426.

[6] 郑璇杏,陈琏,佘溢彬,等. 三种治疗老年慢性病的中成药中非法添加化学药物与检测方法综述[J]. 2023(6):79-82.

[7] 周亚兰,席彰,康靖. 高效液相色谱-串联质谱法检测中成药/保健食品中非法添加的49种化学药物[J]. 2022,13(9):2907-2915.

[8] 王超众,南俊伶,王萌萌,等. 超高效液相色谱-串联质谱法检测抗癫痫类中成药及保健食品中15种非法添加化学药物[J]. 2022,31(1):55-59.