基金项目：温州市基础性科研项目，基于体液外泌体检测的肾癌诊断技术的开发和应用（Y20220187）

通信作者：潘悦

【摘要】目的：探讨肾癌外泌体无创诊断及转移预测评分体系的构建研究。方法：招募2022年1月-12月在笔者医院泌尿外科就诊治疗的100例肾癌的患者为研究对象。招募同时期的50例健康志愿者为对照组。所有患者在纳入研究前签署知情同意。通过蛋白印记分析样本外泌体蛋白组的表达。通过反转录·聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）检测样本外泌体特异性miRNA表达。使用统计方法结合患者数据，构建了一个肾癌诊断及转移预测的评分体系。结果：通过蛋白印记分析样本外泌体蛋白组的表达，观察组外泌体蛋白组特异性蛋白P53（1.03±0.02 vs 2.13±0.19）、EGFR（1.01±0.01 vs 1.98±0.18）、MMP-9（1.05±0.01 vs 2.01±0.20）和ExoC6（1.00±0.01 vs 2.35±0.22）表达较对照组升高（P<0.05）。通过RT-PCR检测样本外泌体特异性miRNA表达，观察组外泌体miR-21（1.05±0.03 vs 2.14±0.20）和miR-34a（1.12±0.05 vs 1.99±0.20）表达较对照组升高（P<0.05），观察组miR-145（1.96±0.18 vs 1.04±0.02）表达较对照组降低（P<0.05）。结论：通过肾癌患者的外泌体蛋白组及特异性miRNA表达成功地构建了一个有前景的肾癌诊断和转移预测评分体系。该评分体系不仅为肾癌的早期诊断提供了新的方法，还为临床医生提供了一个有力的决策工具，有望提高患者的治疗效果和生活质量

【关键词】肾癌患者；外泌体；无创诊断；转移预测评分体系；特异性；miRNA

肾癌是泌尿系统中的一种常见恶性肿瘤，已逐渐成为全球健康的重要负担^[1-3]。随着全球老龄化趋势的加剧，预计肾癌的发病率和死亡率都将进一步增加。尽管近年来医疗技术不断进步，但肾癌的早期诊断仍然面临诸多挑战，这直接影响到患者的治疗结果和生活质量。研究发现，肿瘤细胞释放的外泌体与正常细胞所释放的外泌体在组成和功能上存在显著差异^[4-7]。本研究旨在探讨肾癌外泌体的特征，并尝试构建一个基于外泌体的肾癌无创诊断及转移预测评分体系，期望为临床提供新的、有效的辅助诊断工具。

1 资料与方法

1.1一般资料

招募2022年1月—12月在温州医科大学附属第一医院泌尿外科就诊治疗的100例肾癌的患者为研究对象。患者年龄36-72岁，平均年龄67.38±4.56岁。其中男性患者68例，女性患者32例。招募同时期的50例健康志愿者为对照组。所有患者在纳入研究前签署知情同意。两组一般情况比较无统计学差异，因此两组数据具有可比性。文章中体现了2023版CSCO肾癌诊疗指南的临床参考或执行标准，而且本研究已由医院医学伦理委员会批准实施。

纳入标准：年满18周岁，性别不限；经过临床和影像学等方法明确诊断为肾癌；肾癌患者的组织和外泌体样本可供研究使用；患者必须理解并签署知情同意书，表示他们明确了解研究的目的、过程和风险，并自愿参与。

排除标准：患有其他严重的系统性疾病，可能会干扰肾癌的评估或影响研究；曾接受肾脏手术或治疗（如肾脏切除、放疗、靶向治疗）的患者；接受免疫抑制剂治疗或免疫疾病治疗的患者；孕妇或哺乳期妇女；不同意签署知情同意的患者被排除在外。

1.2 方法

1.2.1 蛋白印记分析

从患者收集100-200 mL的尿液，并通过差速离心技术分离出外泌体。使用RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）破裂外泌体后，利用二辛可宁酸（bicinchoninic acid，BCA）法确定蛋白浓度。随后，加载约20-40μg的蛋白到十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）胶进行电泳，并湿式转移至聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）或硝基纤维素膜。使用化学发光底物检测后，利用图像分析软件测定各蛋白的表达强度，并与参照蛋白进行标准化。

1.2.2 RT-PCR

常规的PCR条件是95°C预变性10 min，随后40个循环，每个循环在95°C变性15s和60°C退火/延伸1 min。数据收集后，使用ΔΔCt方法计算相对miRNA表达差异，同时考虑适当的内参如U6 snRNA进行归一化。为保证准确性，每个样本应重复三次。

1.3观察指标

使用统计方法结合上述获得的数据，构建了一个肾癌诊断及转移预测的评分体系。该评分体系旨在将临床特征与生物标志物结合起来，为医生提供一个更全面、更精确的评估工具。为了验证评分体系的准确性和可靠性，在分期I和IV的肾癌患者中进行了测试，结果显示在这两个极端阶段，评分体系都表现出了很好的诊断效果。进一步扩大了样本量，将其提高到500名患者，以进行更大规模的验证。

1.4统计学处理

本研究采用SPSS20.0统计软件；计量资料采用“均数±标准差”（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ²分析；P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外泌体蛋白组分析

通过蛋白印记分析样本外泌体蛋白组的表达，观察组外泌体蛋白组特异性蛋白P53（1.03±0.02 vs 2.13±0.19）、EGFR（1.01±0.01 vs 1.98±0.18）、MMP-9（1.05±0.01 vs 2.01±0.20）和ExoC6（1.00±0.01 vs 2.35±0.22）表达较对照组升高（P<0.05）。（表1）

表1 肾癌患者与健康对照外泌体特异性蛋白分析（积分光密度值）

2.2 外泌体特异性miRNA分析

通过RT-PCR检测样本外泌体特异性miRNA表达，观察组外泌体miR-21（1.05±0.03 vs 2.14±0.20）和miR-34a（1.12±0.05 vs 1.99±0.20）表达较对照组升高（P<0.05），观察组miR-145（1.96±0.18 vs 1.04±0.02）表达较对照组降低（P<0.05）。（表2）

表2 肾癌患者与健康对照外泌体特异性miRNA表达分析

2.3 肾癌患者临床特征统计

表格3总结了参与研究的肾癌患者的关键临床特征。研究包括了100例肾癌患者，其中转移数量38例（38%），肿瘤类型涵盖了各种亚型和分期，肿瘤大小分布在1.5厘米至8.0厘米之间。临床症状包括血尿、腹痛和恶心等。这些信息为进一步的研究提供了有关肾癌患者的基本特征，有助于更深入地了解肾癌的外泌体特征和评分体系构建。（表3）

表3 肾癌患者临床特征统计

2.4 肾癌诊断及转移预测评分体系构建参数

在肾癌诊断及转移预测评分体系中，外泌体P53和miR-21表达量的系数最高，分别为1.98和2.22，与肾癌的相关性P＜0.01，其95%置信区间分别为1.85-2.33和1.94-2.48。此外肿瘤大小超过5cm的系数为1.68，P＜0.05，其置信区间为1.08-1.33，清细胞型肾癌的系数为1.66，置信区间1.16-1.62，P＜0.05。左肾位置肿瘤系数为0.56，P＞0.05，显示其对诊断和转移无影响。结果提示各参数对肾癌诊断及转移的重要性和相关性，可做为医生评估和预测工具。（图1，表4）

图1 肾癌转移预测评分与miR-21表达相关性

表4 肾癌诊断及转移预测评分体系构建参数

2.5 评分体系在不同肾癌分期患者中的应用效果

在分期I的30例患者中，诊断准确率为90%，AUC为0.89，表明评分体系在早期分期的诊断中表现良好。在分期IV的18例患者中，诊断准确率达到95%，AUC为0.94，表明评分体系在晚期分期的诊断也非常可靠。

3 讨论

研究对比了肾癌患者与健康志愿者的外泌体蛋白组及特异性miRNA表达。结果显示，P53、EGFR、MMP-9和ExoC6等蛋白在观察组的外泌体中表达升高，这些蛋白在许多其他研究中已被证实与肿瘤的生长、转移和血管生成等过程密切相关。此外，miR-21和miR-34a在观察组外泌体中的表达也较高，而miR-145的表达则降低。miRNA作为调控基因表达的关键因子，在多种肿瘤中都被证实与肿瘤的发生、发展和预后有关^[8]。

综上所述，本研究通过肾癌患者的外泌体蛋白组及特异性miRNA表达成功地构建了一个有前景的肾癌诊断和转移预测评分体系。该评分体系不仅为肾癌的早期诊断提供了新的方法，还为临床医生提供了一个有力的决策工具，有望提高患者的治疗效果和生活质量。

参考文献

[1] 刘春辉，张俊杰，郝林. 外泌体源性miRNA在泌尿系统肿瘤诊疗中的研究进展[J]. 中国癌症防治杂志，2023, 15(2): 217-223.

[2] Wilson NR, Acikgoz Y, Hasanov E. Advances in non-clear cell renal cell carcinoma management: From heterogeneous biology to treatment options [J]. Int J Cancer, 2024, 154(6): 947-961.

[3] Mori K, Yanagisawa T, Fukuokaya W, et al. Adjuvant immunotherapy in patients with renal cell carcinoma and urothelial carcinoma: A systematic review and network meta-analysis[D]. Int J Urol, 2024, 31(1): 25-31.

[4] 林玲，刘圆圆，吴俊标. 外泌体源miRNA在肾脏病中的调控及中药的干预研究进展[J].中药药理与临床，2022, 38(4): 210-215

[5]  富智斌，时佳子，顾迪，等. 外泌体在肾癌诊疗中的研究进展[J]. 临床泌尿外科杂志，2020，35(1): 78-82.

[6] 吕建志，刘欢，祝海洲. 外泌体在肾癌诊疗中的应用[J].济宁医学院学报，2021, 44(3): 213-216.

[7] 何泽恩，王坚. 外泌体在常见泌尿系肿瘤诊疗中的研究进展[J]. 医药前沿，2023, 13(15): 46-51.

[8] 李琪，刘璐，李建蓉，等. 外泌体在肾细胞癌临床诊断和预后评估中的价值[J]. 中西医结合心血管病电子杂志，2020, 8(27): 17+ 23.